服务Service

蛋白表达纯化

蛋白表达纯化

重组蛋白表达与纯化技术服务——酵母表达系统

欣百诺目前成熟的表达体系包括:

原核表达系统(大肠杆菌 E. coli表达系统)、酵母表达系统(P. Pichia表达系统)、昆虫细胞表达系统(BEVS表达系统)和哺乳动物细胞表达系统,每种表达系统都具有克级以上的制备能力。欣百诺建立了严格的产品质控体系及一整套完善的客户服务流程、保密制度以确保为客户提供优质的产品及一流的服务。

novoprotein酵母表达体系以毕赤酵母分泌表达为主,达到克级蛋白的生产规模。酵母密码子优化基因合成,酵母表达株高拷贝筛选,结合酵母高密度发酵罐发酵,能够大大提高蛋白分泌表达量。在长期的生产实践过程中,novoprotein积累了丰富的经验并完成数百个酵母项目蛋白的制备。比如有些外源蛋白属于胞内蛋白但如果采用大肠杆菌表达无法获得可溶表达,也难以复性获得活性蛋白;如果采用哺乳细胞或昆虫细胞表达又很难获得高分泌表达量,novoprotein采用酵母分泌表达成功获得了蛋白的高表达。一些糖蛋白或高度糖基化的多肽片段也成功获得了酵母分泌表达。

1step

目标基因亚克隆至酵母表达载体:

将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。
扩增并抽提构建好的表达质粒。
测序验证构建质粒的准确性。
可提供表达载体:pPICZα和pPIC9K。

提供客户:正确构建的重组表达质粒及测序报告。

服务周期:2周

2step

P. Pichia表达菌株电转化:

酶切线性化表达质粒。
将表达质粒通过电转化到高效的P. Pichia表达菌株中。
通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆。
可提供表达菌株:X33,GS115。

提供客户:PCR阳性克隆及PCR结果报告。

服务周期:1周

3step

P. Pichia表达菌株筛选:

将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增,然后换至BMMY培养基中,并加入甲醇诱导表达目标蛋白。
SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况,并挑选合适的阳性酵母株用于目标蛋白的表达。
如果培养上清中检测不到表达,则通过将上清浓缩10倍作用再检测,或通过anti-His Western-blot方法检测目标蛋白表达(无标签情况下,客户需要提供相关抗体)。

提供客户:任意一个客户需要的阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。

服务周期:2周

4step

P. Pichia表达菌株表达优化:

挑选5个阳性克隆进行表达筛选,每24h补加甲醇,诱导24h,48h,72h后,分别进行SDS-PAGE及western blot检测目的蛋白表达情况。

提供客户:任意三个客户需要的阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告。

服务周期:建议3周

5step

目标蛋白表达及纯化:

摇瓶培养1L重组酵母细胞株,诱导表达目标蛋白。
通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。
通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。
通过Western-blot验证目标蛋白正确性。
提供客户:纯化好的目标蛋白1~5mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度最高可达90%以上。

时间:2-3周

            备注:
1. 如果没有获得目标蛋白,仅收取载体构建和表达检测实验费用,一般为5000元。
2. 如果客户需要详细的纯化工艺,包括详细纯化条件及每步结果,则需要加收相应费用。具体收费金额需要根据不同项目情况进行协商。
3. 因为每个重组蛋白的表达量及纯化得率都不相同,我们最终根据实际情况将给客户提供最少1mg,最多5mg的目标蛋白,所收取的费用是相同的。
4. 我们提供的最终产品一般为保存于常规的缓冲液(Tris-HCl,PBS或乙酸-乙酸钠缓冲液)中蛋白质溶液,并且其中不含有尿素或盐酸胍等变性剂。但因为我们无法为每个定制的蛋白建立活性检测系统,所以我们无法保证最终产品的生物学活性,不过我们承诺将会按照最大可能保护其活性的方法来制备目标蛋白。 如果客户一定要求目标蛋白活性,我们可以先提供约50μg纯化后样品供客户检测活性。若样品活性不合格,我们不再提供目标蛋白给客户并只收取本步骤费用的30% ,而如果样品活性合格,我们将提供合同要求的相同质量的目标蛋白给客户并需要加收本步骤费用的100%。 5. 每次Western-blot检测最多7个样品,因为要加入阳性对照,阴性对照以及Marker。本步骤只包含一次免费检测,如果需要更多次检测则需另收费。我们可以免费为客户提供抗His-tag的一抗,如果客户需要使用其他一抗,则需要客户提供。另外由于Western-blot检测结果受很多客观因素影响,因此我们并不能确保检测结果(可能会出现假阳性或是假阴性的结果)。如果结果不正常,我们可以免费重做一次。

6step

目标蛋白的再加工及详细检测

内毒素去除,除菌,冻干等进一步加工。
通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。 将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。

服务内容:

1. 除内毒素
2. 过滤除菌
3. 冻干
4. HPLC检测
5. 质谱检测
提供客户:加工后的终产品及相关实验和检测报告。

时间:1-2周

7step

大规模制备

提供客户:合格的目标蛋白及服务报告。

时间:协商

专注
品质


1

分子生物学
酶类


1余种

细胞
因子


1余种

            上海近岸科技有限公司成立于2004年,是国内首家专门从事重组蛋白质制备工艺开发及生产的高科技企业。
novoprotein 隶属于上海近岸科技有限公司,提供重组蛋白制备相关的全套技术服务。