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mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase, GMP Grad
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2500U / 询价

目录号:GMP-M072-01A


产品描述:


体外转录获得的mRNA未经细胞内一系列修饰,不具备Cap 结构与PolyA 尾,容易降解,易激活免疫反应,不能与核糖体起始蛋白结合,无法启动蛋白翻译,因而在工业化mRNA生产中,需使用牛痘病毒加帽酶对IVT 的mRNA进行加帽修饰,使mRNA的5' 端获得Cap0 结构,进一步使用2'-O- 甲基转移酶将Cap0 转化为Cap1。酶法加帽引入的帽结构与真核生物体内天然帽结构完全一致,从根本上降低外源mRNA 免疫原性的同时,保护其不被降解,并提高翻译效率,增加细胞内蛋白产量。通过酶法加帽最大可获得100%的加帽效率,而通过化学合成帽类似物结构加帽,其加帽效率相对较低,并且帽类似物结构与天然帽结构有差异。

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferas 可利用 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体, 在 RNA 5´末端紧邻帽结构(Cap 0)的第一个核苷酸的 2´-O 上添加甲基基团,形成带有 Cap 1 结构的 mRNA。Cap1 结构能增强 mRNA 的翻译效率,从而可提高转染后 mRNA 编码的蛋白表达水平。该酶只能以带 7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppN)的 RNA 为底物,不会作用于 5´末端为pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。带 7-甲基鸟苷帽结构(m7GpppN)的 RNA 可通过 Vaccinia Capping System(Cat. No: GMP-M062, Novoprotein)来制备。 

本制品利用大肠杆菌大规模发酵表达,采用药用规格原辅料生产,并严格控制宿主蛋白质残留、核酸残留等,符合 GMP 规范的产品生产与质量管理规程保障生产过程及所有原辅料可追溯。 


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图1. mRNA 帽结构 2´ -O-甲基转移酶作用机理。mRNA 的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三磷酸酯桥连接到mRNA 链的5′核苷上组成。Cap-0 结构由相邻的RNA 链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1 结构需要2′O 甲基转移酶的参与,该修饰可以降低RNA 在体内引起的细胞先天免疫反应。本图引自Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51-65 


质量要求: 


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遵循以下规范生产:


1. ISO 9001:2015, certified facility。

2.《GMP 附录-细胞治疗产品》国家药品监督管理局。

3.《人用基因治疗总论-中国药典 2020》国家药典委。

4. USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于细胞治疗,基因治疗和组织工程产品中的辅料。

5. USP Chapter <92>, Growth Factors and Cytokines Used in Cell Therapy Manufacturing 细胞治疗产品生产过程中细胞因子和生长因子。

6. Ph. Eur. General Chapter 5.2.12, Raw Materials of Biological Origin for the Production of Cell-based and Gene Therapy Medicinal Products 用于生产细胞或基因治疗药物的生物来源原料。


产品用途:


   Cap0 结构的 mRNA 2´-O 甲基化(Cap1),以提高 mRNA 的翻译和表达效率。


产品基本信息:


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应用实例:


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完整mRNA在细胞内表达GFP蛋白,加帽酶与帽类似物对比


注意事项:   


1. 用于反应的 RNA 在使用之前应进行纯化并溶解于 RNase-free water。溶液中不能含有 EDTA 和盐;

2. 在配置反应体系时,建议使用 RNase 抑制剂以增强反应中 RNA 的稳定性。可以加入 0.5µl 的 RNase 抑制剂(Cat. No: GMP-E125, Novoprotein),同时去掉等体积的 RNase-free water;

3. 反应之前加热 RNA 可以去除 5´端的二级结构。如果转录产物的 5´端结构复杂,可以把加热时间延长至 10 分钟;

4. SAM 在 pH 7–8, 37°C 条件下不稳定,需要在反应开始之前新鲜配置。可事先计算好 SAM 的用量,在反应开始前将 32 mM的储备液稀释成 4 mM 的工作液。为避免 SAM 降解,该工作液需要保存于冰上。


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For research and manufacturing use only.





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